É necessário uma abstinência sexual de no mínimo 3 dias. A amostra de sêmen é obtida por masturbação, de preferência no laboratório, para fornecer um material fresco e adequado para o espermograma. Esta indicação decorre da necessidade de observação da motilidade espermática, que ocorre aos 30 ou 60 minutos após a coleta. Se não for possível a coleta no laboratório, o paciente deve encaminhar a amostra o mais rápido possível (no máximo em 20 minutos),  comunicando a recepcionista o horário exato da coleta.
Para cultura de esperma (espermocultura) não há necessidade de abstinência sexual, mas igualmente deve ser coletado no laboratório, o paciente deve urinar antes da coleta e fazer uma higiene prévia, lavando bem as mãos e o pênis com bastante água e sabão e secando com gaze estéril ou toalha limpa, a coleta deve ser feita em frasco estéril. Se a coleta for feita em casa, encaminhar ao laboratório no máximo em 30 minutos. Para espermograma pós-vasectomia também não há necessidade de abstinência sexual.